化妝品衛(wèi)生規(guī)范
Hygienic Standard for Cosmetics
中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部 二○○七年一月
第四一部分 微生物檢驗(yàn)方式
Methods of Microbiological Test
一、條例
1 范疇 本規(guī)范要求了化妝品分子生物學(xué)檢測(cè)的主要規(guī)定。
本規(guī)范適用化妝品試品的收集、儲(chǔ)存及供檢試品制取。
2 儀器和設(shè)備
2.1 天平秤。
2.2 髙壓滅菌器。
2.3 震蕩器。
2.4 三角瓶，250mL。
2.5 夾層玻璃珠。
2.6 玻璃棒。
2.7 標(biāo)尺吸管，1mL、10mL。
2.8 研缽或均質(zhì)器。
2.9 控溫水浴箱。
3 培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)試劑
3.1 生理學(xué)鹽水
成份：鈦酸異丙酯鈉 8.5g
純凈水加至 1000mL
溶解后，散裝到加玻璃彈珠的三角瓶里，一瓶 90mL，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min
高壓滅菌。
3.2 SCDLP 液體培養(yǎng)基成份：opo結(jié)構(gòu)脂胨 17g 黃豆蛋白胨 3g 氧化鈉 5g 磷酸鈣氫二鉀 2.5g 紅提糖 2.5g 大豆卵磷脂 1g 司盤(pán) 80 7g 水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：先將大豆卵磷脂在少許純凈水中升溫融解后，再與其他成份混和，加溫融解，調(diào) pH
為 7.2～7.3 散裝，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min 高壓滅菌。留意震蕩，使沉積于最底層的 司盤(pán) 80 充分混和，制冷至 25℃左右應(yīng)用。
注：如無(wú)opo結(jié)構(gòu)脂胨和黃豆蛋白胨，也可以用多胨替代。
3.3 殺菌液體石臘。
3.4 殺菌吐溫 80。
4 樣品的采集及注意事項(xiàng)
4.1 所收集的樣品，應(yīng)具備代表性，一般視每批化妝品數(shù)量大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)各自從2個(gè)包裝單位以上的樣品中國(guó)共產(chǎn)黨取 10g 或 10mL。包裝量低于 20g的樣品，取樣量可適度提升樣品包裝數(shù)量。
4.2 供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗(yàn)前不得開(kāi)啟，防 止樣品被環(huán)境污染。
4.3 收到樣品后，應(yīng)該馬上備案，撰寫(xiě)檢驗(yàn)編號(hào)，并按檢驗(yàn)規(guī)定盡早檢驗(yàn)。如無(wú)法立即檢驗(yàn)， 樣品應(yīng)放到棚溫蔭涼干躁處，不必冷凍或冷藏。
4.4 若僅有一個(gè)樣品而與此同時(shí)需做多種分析，如病菌、毒理、化學(xué)等，則宜先取出一部分樣品 做病菌檢驗(yàn)，再將剩下樣品做其他剖析。
4.5 在檢驗(yàn)全過(guò)程中，從開(kāi)啟包裝到所有檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散， 常用器皿及原材料均應(yīng)事前滅菌，所有操作應(yīng)在無(wú)菌棚里開(kāi)展，或在對(duì)應(yīng)情況下，按無(wú)菌操作 要求開(kāi)展。
4.6 如檢出糞大腸菌群或其他病原菌，自匯報(bào)傳出之日起該菌苗及被檢試品應(yīng)儲(chǔ)存一個(gè)月。
5 供檢樣品的制取
5.1 液態(tài)樣品
5.1.1 水溶性的液體試品，可量取 10mL 加到 90mL 滅菌生理生理鹽水中，如試品低于 10mL， 仍按 10 倍稀釋法開(kāi)展。若為 5mL 則加到 45mL 滅菌鹽水，攪拌后，做成 1：10 檢液。
5.1.2 油性液態(tài)試品，取樣品 10mL，先放 5mL 滅菌液體石蠟攪拌，再加 10mL滅菌的吐
溫 80，在 40℃～44℃水浴中震蕩混和 10min，添加滅菌的鹽水 75mL（在 40℃～44℃ 沙浴中預(yù)溫），在 40℃～44℃水浴中乳化，做成 1：10 的懸液。
5.2 膏、霜、溶劑半固態(tài)狀試品
5.2.1 親水性的樣品：稱(chēng)量 10g，加到配有玻璃彈珠及 90mL滅菌鹽水的三角瓶中，充足 震蕩攪拌，靜放 15min。用其上清液做為 1:10 的檢液。
5.2.2 疏水性試品：稱(chēng)量 10g，放到殺菌的研缽中，加 10mL 滅菌液體石蠟，碾磨成濃稠狀， 再添加 10mL 殺菌司盤(pán) 80，碾磨待溶解后，加 70mL 殺菌生理生理鹽水，在 40℃～44℃水浴中 充足混和，做成 1：10 檢液。
5.3 固態(tài)樣品
稱(chēng)量 10g，加到 90mL 殺菌鹽水中，充足震蕩攪拌，使其分散化混懸，靜放后，取上 發(fā)酵液做為 1：10 的檢液。
若有均質(zhì)器，以上水溶膏、霜、顆粒劑等，可稱(chēng) 10g 樣品添加 90mL殺菌鹽水， 勻質(zhì) 1min～2min；疏水性膏、霜及眉粉、唇膏等，稱(chēng) 10g 樣品，加 10mL殺菌液態(tài)石蠟，
10mL 司盤(pán) 80，70mL 殺菌鹽水，勻質(zhì) 3min～5min。
二、菌數(shù)
1 范疇 本規(guī)范要求了護(hù)膚品中過(guò)氧化值的檢測(cè)方式。 本標(biāo)準(zhǔn)適用護(hù)膚品菌數(shù)的測(cè)量。
2 界定 本規(guī)范選用以下界定
菌體總數(shù)（Aerobic bacterial count）是指護(hù)膚品檢樣通過(guò)解決，在一定情況下塑造后（如 培養(yǎng)液成份、塑造溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH 值、需氧性質(zhì)等），1g（1mL）檢樣中常含菌體的總 數(shù)。所得的結(jié)果只包含一群本方式要求的前提下成長(zhǎng)的嗜常壓的需氧性菌數(shù)。
測(cè)定菌落數(shù)量便于斷定樣品被真菌感染的水平，是對(duì)樣品開(kāi)展衛(wèi)生學(xué)期評(píng)價(jià)的綜合依
據(jù)。
3 儀器和設(shè)備
3.1 三角瓶，250mL。
3.2 容量瓶，200mL。
3.3 pH 計(jì)或高精密 pH 試紙。
3.4 髙壓滅菌器。
3.5 試管嬰兒：15×150mm。
3.6 殺菌平皿：直徑 9cm。
3.7 殺菌刻度塑料吸管，10mL、1mL。
3.8 乙醇燈。
3.9 控溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。
3.10 變大鏡。
4 培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)試劑
4.1 生理學(xué)鹽水：見(jiàn)條例中 3.1。
4.2 卵磷脂、司盤(pán) 80―營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液
| 4.2.1 |
成分：蛋白胨 |
20g |
|
|
牛肉膏 |
3g |
|
|
氧化鈉 |
5g |
瓊脂 15g
大豆卵磷脂 1g 司盤(pán) 80 7g 水蒸氣蒸餾水 1000mL
4.2.2 制作方法：先將卵磷脂加到少量水蒸氣蒸餾水中，加溫溶解，添加司盤(pán) 80，將其他成分（除瓊 脂外）加到其他的純凈水中，融解。加入已分解的大豆卵磷脂、司盤(pán) 80，攪拌，調(diào) pH 數(shù)值 7.1～
7.4，添加瓊脂，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min 高壓滅菌，存儲(chǔ)于冷陰暗處預(yù)留。
4.3 0.5％氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC） 成份：TTC 0.5g
水蒸氣蒸餾水 100mL
融解后過(guò)慮，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min 高壓滅菌，接至粽色玻璃燒杯，置 4℃冰箱 預(yù)留。
5 操作流程
5.1 用滅菌塑料吸管汲取 1：10 稀釋液的檢液 2mL，分別引入到2個(gè)殺菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿 1mL。另
取 1mL 注入到 9mL 滅菌鹽水試管嬰兒中（留意勿使塑料吸管觸碰液位），更換一支塑料吸管，并充 分?jǐn)嚢?span>，做成 1：100 檢液。汲取 2mL，各自引入到2個(gè)殺菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿 1mL。如試品含 菌量高，還可再稀釋液成 1：1000，1：10000，……等，每一種稀釋液度應(yīng)換 1 支塑料吸管。
5.2 將融化并冷至 45℃～50℃的卵不飽和脂肪酸吐溫 80 營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)液竭盡到培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約15mL，隨后旋轉(zhuǎn)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充足攪拌勻稱(chēng)，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置 36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)塑造 48h±2h。另取一個(gè)不用樣品的殺菌空平皿，添加約 15mL 大豆卵磷脂司盤(pán)80 營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置 36℃±1℃塑造箱里塑造 48h±2h，為空 白對(duì)比。
5.3 為便于棚別護(hù)膚品中的顆粒物與菌體，可在每 100mL 卵磷脂司盤(pán) 80 營(yíng)養(yǎng)瓊脂中添加 1mL 0.5％的 TTC 飽和溶液，若有病菌存有，塑造后菌體呈鮮紅色，而護(hù)膚品的顆粒物色調(diào)無(wú)轉(zhuǎn)變。
6 菌落計(jì)數(shù)方式
先用眼睛觀查，等級(jí)菌體數(shù)，隨后再用變大 5 倍～10 倍的高倍放大鏡查驗(yàn)，防止忽略。記 下各平皿的菌體數(shù)后，求出同一稀釋液度各平皿生長(zhǎng)發(fā)育的均值菌體數(shù)。若平皿中有連接成塊狀的菌 落或花點(diǎn)樣菌體擴(kuò)散生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)，該平皿不適合記數(shù)。若塊狀菌體不上平皿中的一半，而其他一半 中菌體數(shù)遍布又十分勻稱(chēng)，則可將此大半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘于 2，以代表全皿菌體數(shù)。
7 菌落計(jì)數(shù)及匯報(bào)方法
7.1 最先選取均值菌體數(shù)在 30 個(gè)～300 個(gè)中間的平皿，做為菌落總數(shù)測(cè)定的范疇。當(dāng)僅有 一個(gè)稀釋液度的均值菌體數(shù)合乎此范疇時(shí)，就是以該平皿菌體數(shù)乘其稀釋液倍數(shù)（見(jiàn)表 1 中例 1）。
7.2 若有兩個(gè)稀釋度，其均值菌體數(shù)均在 30 個(gè)～300 個(gè)中間，則應(yīng)求出兩菌數(shù)之比率 來(lái)決策，若其比率小于或等于 2，應(yīng)匯報(bào)其平均值，若超過(guò) 2 則匯報(bào)其中稀釋液度較低的平皿
的菌落數(shù)（見(jiàn)表 1 中例 2 及例 3）。
7.3 若所有稀釋液度的均值菌落數(shù)均超過(guò) 300 個(gè)，則應(yīng)按稀釋液度最大的均值菌落數(shù)乘于稀釋液 倍率匯報(bào)之（見(jiàn)表 1 中例 4）。
7.4 若所有稀釋液度的均值菌落數(shù)均低于 30 個(gè)，則應(yīng)按稀釋液度最少的均值菌落數(shù)乘于稀釋液倍 數(shù)匯報(bào)之（見(jiàn)表 1 例 5）。
7.5 若所有稀釋液度的均值菌落數(shù)均沒(méi)有在 30 個(gè)～300 個(gè)中間，在其中一個(gè)稀釋液度超過(guò) 300 個(gè)， 而鄰近的另一稀釋液度低于 30 個(gè)時(shí)，則以貼近 30 或 300 的平均菌落數(shù)乘于稀釋倍數(shù)匯報(bào)之（見(jiàn)
表 1 中例 6）。
7.6 若所有的稀釋液度均無(wú)菌檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育，匯報(bào)數(shù)為每 g 或每 mL 小于 10CFU。
7.7 菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在 10 之內(nèi)時(shí)，按登記標(biāo)值匯報(bào)之，超過(guò) 100 時(shí)，采用二位有 效數(shù)據(jù)，在二位有效數(shù)字后邊的標(biāo)值，應(yīng)以四舍五入法測(cè)算。為了更好地減少數(shù)據(jù)后邊零的數(shù)量， 可以用 10 的指數(shù)來(lái)表示（見(jiàn)表 1 報(bào)告方法欄）。在匯報(bào)菌落數(shù)為“不能計(jì)”時(shí)，應(yīng)標(biāo)明試品的 稀釋液度。
| 1 |
1365 |
164 |
20 |
─ |
16400 |
16000 或 1.6×104 |
||||
| 2 |
2760 |
295 |
46 |
1.6 |
38000 |
38000 或 3.8×104 |
||||
| 3 |
2890 |
271 |
60 |
2.2 |
27100 |
27000 或 2.7×104 |
||||
| 4 |
不能計(jì) |
4650 |
513 |
─ |
513000 |
510000 或 5.1×105 |
||||
| 5 |
27 |
11 |
5 |
─ |
270 |
270 或 2.7×102 |
||||
| 6 |
不能計(jì) |
305 |
12 |
─ |
30500 |
31000 或 3.1×104 |
||||
| 7 |
0 |
0 |
0 |
─ |
＜１×10 |
|
*CFU：菌落形成企業(yè)。
三、糞大腸菌群
1 范疇 本規(guī)范要求了護(hù)膚品中糞大腸菌群的檢測(cè)方式。 本規(guī)范適用護(hù)膚品中糞大腸菌群的檢測(cè)。
2 界定 本規(guī)范選用以下界定
糞大腸菌群（Fecal coliforms）系一群需氧及兼性厭氧革蘭呈陰性無(wú)芽胞桿菌，在 44.5
℃±0.5℃培養(yǎng) 24h～48h 能發(fā)醇乳清蛋白產(chǎn)酸并脹氣。 該菌立即來(lái)源于排泄物，是主要的環(huán)境衛(wèi)生指示菌。
3 儀器設(shè)備
3.1 控溫水浴箱或防水防火式恒溫箱：44℃±0.5℃。
3.2 溫度計(jì)。
3.3 顯微鏡鏡。
3.4 載玻片。
3.5 注射環(huán)。
3.6 電磁感應(yīng)爐。
3.7 三角瓶，250mL。
3.8 試管嬰兒：15×150mm。
3.9 小倒管。
3.10 pH 計(jì)或 pH 測(cè)紙。
3.11 髙壓滅菌器。
3.12 殺菌吸管，10mL、1mL。
3.13 殺菌平皿：直徑 90mm。
4 培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)試劑
4.1 二倍乳糖膽鹽（含還原劑）培養(yǎng)液 成份：蛋白胨 40g
豬膽鹽 10g
乳清蛋白 10g
0.4％溴甲酚紫水溶性液 5mL 大豆卵磷脂 2g 司盤(pán) 80 14g 水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：將大豆卵磷脂、司盤(pán) 80 溶解到少許純凈水中。將蛋白胨、膽鹽及乳清蛋白融解到其他的 純凈水中，加到一起攪拌，調(diào) pH 到 7.4，添加 0.4％溴甲酚紫溶液，攪拌，散裝試管（每 支試管嬰兒里加一個(gè)小倒管）。68.95kPa（115℃ 10 lb）20min 殺菌。
4.2 伊紅美蘭（EMB）瓊脂
成份：蛋白胨 10g
乳清蛋白 10g
磷酸氫二鉀 2g 瓊脂 20g
2％伊紅水飽和溶液 20mL
0.5％美水藍(lán)溶液 13mL
水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：先將瓊脂加到 900mL 蒸餾水里，加溫融解，隨后添加磷酸氫二鉀蛋白胨，攪拌， 使之融解。再以純凈水補(bǔ)充至 1000mL。校準(zhǔn) pH 值為 7.2～7.4，散裝于三角瓶?jī)?nèi)，103.43kPa
（121℃ 15 lb）15min 高壓滅菌預(yù)留。臨用時(shí)添加乳清蛋白并加溫溶化瓊脂。冷至 60℃上下無(wú) 菌實(shí)際操作添加殺菌的伊紅美藍(lán)飽和溶液，混勻。竭盡培養(yǎng)皿預(yù)留。
4.3 蛋清胨水（作靛栽培基質(zhì)實(shí)驗(yàn)用） 成份：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g
氧化鈉 5g
水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：將所述成份加溫溶化，調(diào) pH 數(shù)值 7.0～7.2，分裝小試管嬰兒，103.43kPa（121℃ 15
lb）15min 高壓滅菌。
4.4 靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)試劑
柯凡克實(shí)驗(yàn)試劑：將 5g 對(duì)二甲氨基苯甲醛融解于 75mL 戊醇中，隨后慢慢添加濃鹽酸 25mL。 實(shí)驗(yàn)方法：注射病菌于蛋白胨水里，于 44℃±0.5℃培養(yǎng) 24h±2h。沿壁厚加柯凡克試
劑 0.3mL～0.5mL，輕晃試管嬰兒。陽(yáng)性者于實(shí)驗(yàn)試劑層顯深玫瑰紅色。 注：蛋白胨應(yīng)帶有充足的谷氨酸，每次蛋白胨買(mǎi)回來(lái)后，應(yīng)先用已經(jīng)知道菌種鑒定后才可應(yīng)用。
4.5 革蘭氏上色液：
4.5.1 染液制取
4.5.1.1 結(jié)晶紫上色液：
結(jié)晶紫 1g
95％乙酸乙酯 20mL
1％鹽酸銨水溶性液 80mL
將結(jié)晶紫溶解乙酸乙酯中，隨后與草酸銨飽和溶液混和。
4.5.1.2 革蘭氏碘液：
碘 1g 碘化鉀 2g 蒸餾水加至 300mL
將碘與碘酸鉀先開(kāi)展混和，添加純凈水少量，充足振搖，待充分融解后，再加純凈水至
300mL。
4.5.1.3 脫色液：95％乙醇。
4.5.1.4 復(fù)染液：
（1）沙黃復(fù)染液：
沙黃 0.25g
95％乙醇 10mL 蒸餾水 90mL 將沙黃融解于乙酸乙酯中，隨后用純凈水稀釋液。
（2）稀石碳酸復(fù)紅液：稱(chēng)量偏堿復(fù)紅 10g，研細(xì)，加 95％乙酸乙酯 100mL，置放留宿，濾 紙過(guò)慮。取該液 10mL，加 5％石碳酸溶液 90mL 混和，即是石碳酸復(fù)紅液。再取此液 10mL 放水 90mL，即是稀石碳酸復(fù)紅液。
4.5.2 染色法
4.5.2.1 將涂片在火苗上固定不動(dòng)，滴入結(jié)晶紫上色液，染 1min，水清洗。
4.5.2.2 滴加革蘭氏陽(yáng)性菌碘液，功效 1min，水清洗。
4.5.2.3 滴加 95％乙醇褪色，約 30s，或?qū)⒁宜嵋阴サ螡M全部玻片，馬上傾去，再用乙酸乙酯滴滿整 個(gè)玻片，褪色 10s，水洗。
4.5.2.4 滴加復(fù)染液，復(fù)染 1min，水清洗，待干，鏡檢查。
4.5.3 染色結(jié)果 革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈鮮紅色。
注：如用 1:10 稀釋液石碳酸復(fù)紅上色液作復(fù)染，復(fù)染時(shí)間僅需 10s。
5 操作流程
5.1 取 10mL 1：10 稀釋的檢液，加到 10mL 二倍乳清蛋白膽鹽（含還原劑）培養(yǎng)液中，置 44
℃±0.5℃培養(yǎng)箱中塑造 24h～48h，如不產(chǎn)酸都不脹氣，則匯報(bào)為糞大腸菌群呈陰性。
5.2 如產(chǎn)酸脹氣，畫(huà)線注射到伊紅美藍(lán)瓊脂平板電腦上，置 36℃±1℃培養(yǎng) 18h～24h。與此同時(shí)取 該栽培基質(zhì) 1～2 滴注射到蛋白胨水里，置 44℃±0.5℃塑造 24h±2h。
經(jīng)培養(yǎng)后，在以上平板電腦上觀查有沒(méi)有典型性菌落生長(zhǎng)發(fā)育。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)液上 的典型性菌落呈深黑紫色，環(huán)形，邊緣齊整，表面光潔潮濕，常具備金屬光澤。也是有的呈紫黑色 色，不帶或有點(diǎn)金屬光澤，或淺紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)留意選擇。
5.3 挑菌上述異常菌落，玻片作革蘭氏染色鏡檢查。
5.4 在蛋白胨水栽培基質(zhì)中，添加靛栽培基質(zhì)實(shí)驗(yàn)試劑約 0.5mL，觀查靛栽培基質(zhì)反映。陽(yáng)性者液位呈玫 瑰鮮紅色；陰性反應(yīng)液位呈實(shí)驗(yàn)試劑原色。
6 檢驗(yàn)結(jié)果匯報(bào) 依據(jù)發(fā)醇乳清蛋白產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板電腦上面有典型性菌落，并經(jīng)確認(rèn)為革蘭呈陰性短鏈球菌，靛栽培基質(zhì)試
驗(yàn)呈陽(yáng)性，則可匯報(bào)被檢試品中驗(yàn)出糞大腸菌群。
四、銅綠假單胞菌
1 范疇 本規(guī)范要求了護(hù)膚品中銅綠假單胞菌的檢測(cè)方式。 本標(biāo)準(zhǔn)適用護(hù)膚品中銅綠假單胞菌的檢測(cè)。
2 界定 本標(biāo)準(zhǔn)選用以下界定。
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，空氣氧化 酶呈陽(yáng)性，能造成綠膿菌素。除此之外還能汽化果膠，復(fù)原磷酸鹽為硝酸鹽，在 42℃±1℃標(biāo)準(zhǔn) 下會(huì)生長(zhǎng)發(fā)育。
該菌對(duì)人會(huì)有發(fā)病力，可使患處潰爛，造成敗血病等。
3 儀器設(shè)備
3.1 塑造箱：42℃±1℃、36℃±1℃。
3.2 三角瓶，250mL。
3.3 試管嬰兒：15×150mm。
3.4 殺菌平皿：直徑 90mm。
3.5 殺菌刻度塑料吸管，10mL、1mL。
3.6 顯微鏡鏡。
3.7 載玻片。
3.8 注射針、接種環(huán)。
3.9 電磁感應(yīng)爐。
3.10 髙壓滅菌器。
4 培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)試劑
4.1 SCDLP 液體培養(yǎng)基 見(jiàn)總則中 3.2。
4.2 十六烷基三羥基溴化銨培養(yǎng)液
成份：牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氧化鈉 5g 十六甲基三羥基溴化銨 0.3g 瓊脂 20g 水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：除瓊脂外，將所述成份混和加溫融解，調(diào) pH 為 7.4～7.6，添加瓊脂，68.95kPa
（115℃ 10 lb）20min 滅菌后，做成平板電腦預(yù)留。
4.3 乙酰胺培養(yǎng)液
成份：乙酰胺 10.0g 鈦酸異丙酯鈉 5.0g 沒(méi)有水磷酸鈣氫二鉀 1.39g
沒(méi)有水磷酸鈣二氫鉀 0.73g 鹽酸鎂（MgSO4.7H2O） 0.5g 酚紅 0.012g 瓊脂 20g 水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：除瓊脂和酚紅外線，將其他成份加到純凈水中，加溫融解，調(diào) pH 為 7.2，添加瓊 脂、酚紅，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min 髙壓滅菌后，做成平板電腦預(yù)留。
4.4 綠膿菌素測(cè)量用培養(yǎng)液
成份：蛋清胨 20g 鈦酸異丙酯鎂 1.4g 鹽酸鉀 10g 瓊脂 18g 凡士林（化學(xué)純） 10g 水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：將蛋白胨、氧化鎂和硫酸銨加到純凈水中，升溫使其融解，調(diào) pH 至 7.4，添加 瓊脂和凡士林，加溫融解，散裝于試管嬰兒內(nèi)，68.95kPa（115℃ 10 lb）20min高壓滅菌后，做成
斜坡預(yù)留。
4.5 果膠培養(yǎng)基
成份：牛羊肉膏 3g 蛋清胨 5g 明膠 120g 水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：取各成份加到純凈水中泡浸 20min，隨時(shí)隨地拌和升溫使之融解，調(diào) pH 至 7.4，分裝 于試管嬰兒內(nèi)，經(jīng) 68.95kPa（115℃ 10 lb）20min 滅菌后，站立做成高層住宅預(yù)留。
4.6 氰化鈉鹽蛋白胨水培養(yǎng)液
成份：蛋清胨 10g 酵母菌浸膏 3g 氰化鈉鉀 2g 亞硝酸鹽鈉 0.5g 水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：將蛋白胨和酵母浸膏加到純凈水中，加溫使之融解，調(diào) pH 為 7.2，煮沸過(guò)慮后 補(bǔ)充水率，添加硝酸鉀和亞硝酸鈉，融解攪拌，散裝到加上小倒管的試管嬰兒中，68.95kPa（115
℃ 10 lb）20min 殺菌儲(chǔ)備用。
4.7 一般瓊脂斜坡培養(yǎng)液
成份：蛋清胨 10g 牛羊肉膏 3g 鈦酸異丙酯鈉 5g 瓊脂 15g 水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：除瓊脂外，將其他成份融解于純凈水中，調(diào) pH 為 7.2～7.4，添加瓊脂，加溫溶 解，散裝試管嬰兒，103.43kPa（121℃ 10 lb）20min 高壓滅菌后，做成斜坡預(yù)留。
5 操作流程
5.1 增菌培養(yǎng)：取 1:10 試品封閉液 10mL 加到 90mL SCDLP 液體培養(yǎng)基中，置 36℃±1℃
塑造 18h～24h。若有銅綠假單胞菌生長(zhǎng)發(fā)育，栽培基質(zhì)表層多有一層薄菌膜，栽培基質(zhì)常呈淺綠色 或深藍(lán)色。
5.2 分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑菌培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三羥基溴化銨瓊脂平板 上，置 36℃±1℃塑造 18h～24h。凡銅綠假單胞菌在這里培養(yǎng)液上，其菌體平扁無(wú)定形，向周 邊蔓延或略微擴(kuò)散，表層潮濕，菌體呈灰白，菌體周邊培養(yǎng)液常蔓延有水溶黑色素，此培 養(yǎng)基可選擇性強(qiáng)，腸子艾希氏菌不可以生長(zhǎng)發(fā)育，革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)較弱。
在缺乏十六烷三丙基溴化銨瓊脂時(shí)也可以用乙酰胺培養(yǎng)液開(kāi)展分離出來(lái)，將菌液畫(huà)線注射于平 板上，放 36℃±1℃塑造 24h±2h，銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)優(yōu)良，菌落平扁，邊沿 不齊，菌落周邊培養(yǎng)基略帶淡粉色，其他菌不生長(zhǎng)。
5.3 染色鏡檢：挑取可疑的菌落，玻片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏呈陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶 實(shí)驗(yàn)。
5.4 氧化酶試驗(yàn)：取一一小塊潔凈的乳白色濾紙片放到滅菌平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻璃棒挑取銅綠假 單胞菌異常菌落涂在過(guò)濾紙上面，隨后在其上滴入一滴新配置的 1％二甲基對(duì)苯二胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在
15s～30s 之內(nèi)，發(fā)生粉色或暗紫色時(shí)，為氧化酶實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性；若塑造物不掉色，為空氣氧化酶試 驗(yàn)呈陰性。
5.5 綠膿菌素實(shí)驗(yàn)：取異常菌落 2 個(gè)～3 個(gè)，各自注射在綠膿菌素測(cè)量培養(yǎng)基上，置 36℃
±1℃塑造 24h±2h，加入乙醚 3mL～5mL，充足震蕩使塑造物中的綠膿菌素融解于乙醚液 內(nèi)，待氯仿萃取液呈深藍(lán)色時(shí)，用塑料吸管將乙醚移到另一試管嬰兒中并添加 1mol/L 的硫酸 1mL 上下， 振蕩后，靜置一會(huì)兒。如頂層鹽酸液內(nèi)發(fā)生粉色色到紫紅色時(shí)為陽(yáng)性，表明被檢物中有綠膿 菌素存有。
5.6 硝磷酸鹽復(fù)原產(chǎn)氣試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽胨水養(yǎng)養(yǎng)基 中，置 36℃±1℃塑造 24h±2h，觀察結(jié)果。凡在磷酸鹽胨水培養(yǎng)液內(nèi)的小倒管內(nèi)有汽體者， 即是呈陽(yáng)性，說(shuō)明該菌能復(fù)原磷酸鹽，并將硝酸鹽溶解造成氫氣。
5.7 明黏劑化試驗(yàn)，取銅綠假單胞菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置
36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h，取下放電冰箱 10min～30min，如仍呈融解狀或表層融解時(shí)即是果膠 汽化實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性；如凝結(jié)不溶者為呈陰性。
5.8 42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，注射在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上， 放到 42℃±1℃培養(yǎng)箱中，塑造 24h～48h，銅綠假單胞菌能生長(zhǎng)，為呈陽(yáng)性，而類(lèi)似的瑩光假 單胞菌則不可以生長(zhǎng)。
6 檢驗(yàn)結(jié)果匯報(bào) 被檢樣品經(jīng)增菌分離出來(lái)培育后，經(jīng)確認(rèn)為革蘭呈陰性鏈球菌，氧化酶及綠膿菌素實(shí)驗(yàn)皆為陽(yáng)
性者，就可以匯報(bào)被檢試品中驗(yàn)出銅綠假單胞菌；如綠膿菌素實(shí)驗(yàn)呈陰性而汽化果膠、磷酸鹽還 原產(chǎn)地氣和 42℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)三者皆為呈陽(yáng)性時(shí)，仍可匯報(bào)被檢試品中驗(yàn)出銅綠假單胞菌。
五、橙黃色金黃葡萄球菌
1 范疇 本規(guī)范要求了護(hù)膚品中金黃色金色葡萄球菌的檢測(cè)方式。 本標(biāo)準(zhǔn)適用護(hù)膚品中橙黃色葡萄球菌感染的檢測(cè)。
2 界定 本標(biāo)準(zhǔn)選用以下界定
金黃色色紅提球菌（Staphylococcus aureus）為革蘭氏呈陽(yáng)性革蘭陰性桿菌，呈紅提狀排序，無(wú)芽胞， 無(wú)莢膜，能溶解甘油果糖，血液凝結(jié)酶呈陽(yáng)性。
該菌是金黃葡萄球菌中對(duì)人們發(fā)病力最強(qiáng)的一種，能造成身體部分病毒性疾病，比較嚴(yán)重時(shí)可微 致敗血病。
3 儀器和設(shè)備
3.1 顯微鏡鏡。
3.2 控溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。
3.3 離心式機(jī)。
3.4 殺菌吸管，1mL、10mL。
3.5 殺菌試管：15×150mm。
3.6 載玻片。
3.7 乙醇燈。
4 培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)試劑
4.1 SCDLP 液體培養(yǎng)基 見(jiàn)總則中 3.2。
4.2 7.5％的氧化鈉骨頭湯
成份：蛋清胨 10g 牛羊肉膏 3g 鈦酸異丙酯鈉 75g
純凈水加至 1000mL
制作方法：將所述成份加溫融解，調(diào) pH 為 7.4，散裝，103.43kPa（121℃ 15 lb）15min 高 壓殺菌。
4.3 Baird Parker 平板電腦
成份：胰蛋清胨 10g 牛羊肉膏 5g 酵母菌浸膏 1g 甲苯酸鈉 10g 甘氨酸 12g 氯化鋰（LiCl?6H2O） 5g
瓊脂 20g
水蒸氣蒸餾水 950mL
pH7.0±0.2
增菌劑的配置：30％卵黃生理鹽水 50mL 與殺菌過(guò)慮的 1％亞碲酸鉀飽和溶液 10mL 混和，儲(chǔ)存 于電冰箱內(nèi)。
制作方法：將各成份加到純凈水中，加溫?zé)_(kāi)徹底融解，冷至 25℃±1℃校準(zhǔn) pH。散裝每
瓶 95mL，103.43kPa（121℃ 15 lb）高壓殺菌 15min。臨用時(shí)加溫融化瓊脂，每 95mL 添加 加熱至 50℃上下的卵黃亞碲酸鉀增菌劑 5mL，混勻后竭盡平板電腦。培養(yǎng)液該是高密度不通透的。 應(yīng)用前在電冰箱存儲(chǔ)不能超過(guò) 48h±2h。
4.4 血瓊脂培養(yǎng)液
成份：營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂 100mL
脫化學(xué)纖維羊血（或兔血） 10mL
制作方法：將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加溫融化，待冷至 50℃上下無(wú)菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，做成 平板電腦，置電冰箱內(nèi)預(yù)留。
4.5 甘霖醇發(fā)醇培養(yǎng)液
成分：蛋白胨 10g 氧化鈉 5g 甘油果糖 10g 牛肉膏 5g
0.2％麝香草酚藍(lán)溶液 12mL
水蒸氣蒸餾水 1000mL
制作方法：將蛋白胨、氧化鈉、牛肉膏加到純凈水中，加溫融解，調(diào) pH7.4，加入甘油果糖和 顯色劑，攪拌后散裝試管嬰兒中，68.95kPa（115℃ 10 lb）20min 殺菌預(yù)留。
4.6 兔（人）血液制取
取 3.8％三聚磷酸鈉飽和溶液，103.43kPa（121℃ 15 lb）30min 高壓滅菌，1 份加兔（人）全
血 4 份，混勻靜放；2000rpm～3000rpm 離心式 3min～5min。血球下移，取上邊血液。
5 操作流程
5.1 增菌：取 1：10 稀釋的試品注射到 90mL SCDLP 液體培養(yǎng)基中，置 36℃±1℃培養(yǎng)箱， 培養(yǎng) 24h±2h。
注：如不存在培養(yǎng)基也可用 7.5％氯化鈉肉湯。
5.2 分離出來(lái)：自以上增菌培養(yǎng)液中，取 1～2 接種環(huán)，畫(huà)線注射在Baird Parker 氏培養(yǎng)基，如 不存在培養(yǎng)基也可畫(huà)線注射到血瓊脂平板電腦，置 36℃±1℃培養(yǎng) 24h～48h。在血瓊脂平板上菌體 呈橙黃色，大而凸起，環(huán)形，不全透明，表層光潔，周邊有溶血圈。在 Baird Parker 氏培養(yǎng)基 上為環(huán)形，光潔，突起，潮濕，直徑為 2mm～3mm，顏色呈深灰色到灰黑色，邊沿為淺色，周 圍為一渾濁帶，在其表層有一透明帶。用接種針觸碰菌體似有鮮奶油樹(shù)脂膠的柔韌度。不經(jīng)意會(huì)碰到 非人體脂肪融解的相近菌體，但無(wú)渾濁帶及透明帶。挑菌單獨(dú)菌體分純?cè)?/span>血瓊脂平板電腦上，置 36
℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h。
5.3 染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢查。金黃色葡萄球菌為革蘭氏 陽(yáng)性菌，排成紅提狀，無(wú)芽胞，無(wú)夾膜，高致病金黃葡萄球菌，菌體較小，直徑大約為 0.5ìm～
1ìm。
5.4 甘露醇發(fā)醇試驗(yàn)：取上述分純菌體接種到甘霖醇發(fā)酵塑造基中，在培養(yǎng)基液表面加入
2mm～3mm 的殺菌液體石蠟，置 36℃±1℃塑造 24h±2h，橙黃色金黃葡萄球菌應(yīng)能發(fā)醇甘油果糖 產(chǎn)酸。
5.5 血液凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)：汲取 1:4 新鮮血液 0.5mL，放進(jìn)殺菌小試管嬰兒中，添加待檢菌 24h±2h 骨頭湯培育物 0.5mL。攪拌，放 36℃±1℃恒溫箱或恒溫水浴槽中，每半小時(shí)觀查一次，6h 以?xún)?nèi) 如展現(xiàn)稠狀即是陽(yáng)性。與此同時(shí)以已經(jīng)知道血液凝固酶呈陽(yáng)性和呈陰性菌種肉湯培養(yǎng)物及骨頭湯培養(yǎng)基各
0.5mL，分別添加殺菌 1:4 血液 0.5mL，攪拌，做為對(duì)比。
6 檢驗(yàn)結(jié)果匯報(bào) 凡在上述挑選平板電腦上面有異常菌體生長(zhǎng)發(fā)育，經(jīng)上色鏡檢查，證實(shí)為革蘭氏陽(yáng)性金黃葡萄球菌，并能發(fā)醇甘油果糖產(chǎn)酸，血液凝結(jié)酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性者，可匯報(bào)被檢試品驗(yàn)出橙黃色金黃葡萄球菌。
六、黃曲霉菌和酵母
1 范疇 本規(guī)范要求了護(hù)膚品中黃曲霉菌和酵母數(shù)的檢驗(yàn)方式。 本標(biāo)準(zhǔn)適用各種各樣護(hù)膚品中黃曲霉菌和酵母的記數(shù)。
2 界定 本標(biāo)準(zhǔn)選用以下界定。
黃曲霉菌和酵母數(shù)測(cè)定（Determination of molds and yeast count）就是指化妝品檢員樣在一定條 件下塑造后，1g 或 1mL 護(hù)膚品中所環(huán)境污染的活的黃曲霉菌和酵母總數(shù)，藉以斷定護(hù)膚品被黃曲霉菌 和酵母環(huán)境污染水平以及一般衛(wèi)生條件。
己方法依據(jù)黃曲霉菌和酵母特有的狀態(tài)和塑造特點(diǎn)，在虎紅培養(yǎng)液上，置 28℃±2℃塑造72h，計(jì)算機(jī)所生長(zhǎng)發(fā)育的黃曲霉菌和酵母數(shù)。
3 儀器和設(shè)備
3.1 塑造箱：28℃±2℃。
3.2 震蕩器。
3.3 天平秤。
3.4 三角瓶，250mL。
3.5 試管嬰兒：15×150mm。
3.6 培養(yǎng)皿：直徑 9cm。
3.7 塑料吸管，1mL、10mL。
3.8 容量瓶，200mL。
3.9 乙醇燈。
3.10 髙壓滅菌器。
4 培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)試劑
4.1 生理學(xué)鹽水 見(jiàn)條例中 3.1。
4.2 虎紅（孟加拉國(guó)紅）培養(yǎng)液
成份：蛋白胨 5g 葡萄糖水 10g 磷酸二氫鉀 1g 鹽酸鎂（含 7H2O） 0.5g 瓊脂 20g
1/3000 虎紅溶液 100mL
（四氯四碘熒光素）
水蒸氣蒸餾水 1000mL
氯霉素 100mg
制作方法：將上述各成份（除虎紅外線）添加水蒸氣蒸餾水中融解后，再添加虎紅飽和溶液。分裝后，103.43kPa（121℃ 15 lb）20min 高壓滅菌，另用少許乙酸乙酯融解氯霉素，過(guò)慮融解后添加培養(yǎng)基中，如果沒(méi)有氯霉素，應(yīng)用時(shí)每 1000mL 加氨芐青霉素 30mg。
5 操作流程
5.1 試品稀釋 見(jiàn)菌落總數(shù)測(cè)定中 6.1。
5.2 取 1：10、1：100、1：1000 的檢液各 1mL 各自引入殺菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每一個(gè)稀釋液度各用 2
個(gè)培養(yǎng)皿，引入溶化并冷至 45℃±1℃上下的虎紅培養(yǎng)液，充足混勻。凝結(jié)后，旋轉(zhuǎn)平板電腦，置
28℃±1℃培養(yǎng) 72h±2h，記數(shù)平板電腦內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的霉菌和酵母菌數(shù)。若有霉菌擴(kuò)散生長(zhǎng)發(fā)育，為防止 危害其他黃曲霉菌和酵母的記數(shù)時(shí)，于 48h±2h 應(yīng)立即將此平板電腦取下記數(shù)。
5.3 計(jì)算方法：先點(diǎn)數(shù)每一個(gè)平板上生長(zhǎng)發(fā)育的霉菌和酵母菌菌落數(shù)，求出每一個(gè)稀釋度的平均菌 落數(shù)。判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)選擇菌體數(shù)在 5 個(gè)～50 個(gè)范圍內(nèi)的培養(yǎng)皿記數(shù)，乘于稀釋倍數(shù)后， 即是每 g（或每 mL）檢樣中常含的黃曲霉菌和酵母數(shù)。其他區(qū)域內(nèi)的菌體數(shù)匯報(bào)應(yīng)參考菌體 數(shù)量的匯報(bào)方式匯報(bào)之。
5.4 每 g（或每 mL）化妝品含霉菌和酵母菌數(shù)以 CFU/g（mL）表明。
全文連接：http://www.emuhill.com/
化妝品環(huán)境衛(wèi)生行政許可事項(xiàng)檢測(cè)要求（2007年版）
化妝品優(yōu)良生產(chǎn)制造標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)（GMPC）
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